*本文只作阅读笔记分享*

组织工程是一个多学科领域旨在开发人工生物组织替代物用于再生医学和药物研究。

传统的组织工程方法使用三维预制支架作为基质来负载细胞但这些方法在模仿生物组织的复杂微结构和定义细胞的空间位置及分布方面存在局限性。

1.2

3D生物打印作为一种新兴技术有望彻底改变组织工程和再生医学领域。

它通过精确放置活细胞和生物材料来创建复杂的复合组织构建物具有以下优势

能够以微米级精度沉积生物材料对支架制造和细胞分布具有有效控制。

1.3

模型设计利用磁共振MRI或计算机断层扫描CT成像技术获取目标组织的结构和形态信息。

模型重建将记录的图像重建为3D生物打印模型并转换为可被生物打印机读取的文件格式如gcode。

1.3.2

3D生物打印使用基于喷墨、激光或挤出的生物打印系统根据MRI或CT扫描的组织模型引导打印3D细胞负载支架。

1.3.3

支架成熟将细胞负载支架置于生物反应器中进行体外成熟培养以增强所需组织构建物的发育。

应用3D生物打印的人体组织可用于移植、药物发现和体外疾病研究等领域。

二、技术方法

3D生物打印始于计算机辅助过程用于设计定义明确的3D生物模型。

具体步骤如下

使用计算机辅助设计软件如CAD、Solidwork创建3D模型或从医学影像如MRI和CT中导入数据。

软件设计的3D模型数据具有更大的设计自由度例如晶格和圆形模型。

使用患者特定组织的尺寸和形态生成的3D模型能够创建更接近人体组织的定制化3D构建体。

将3D模型转换为标准

code等文件格式以便打印机能够读取并指导生物元素的逐层沉积。

2.2

几种增材制造技术已被用于制造3D支架其中喷墨式、激光辅助和挤出式生物打印常用于制造人体组织的3D细胞负载支架每种技术都有其特定的优势、劣势和局限性具体如下

2.2.1

原理喷墨生物打印于2003年首次发表与传统的2D喷墨打印非常相似。

喷墨生物打印机将控制量的生物墨水输送到所需的打印表面使内容物连续流动连续喷墨打印或从喷嘴中滴落按需喷墨打印。

细胞负载的生物溶液存储在墨盒中电子控制的升降台提供喷墨打印机中Z轴的控制。

在生物打印过程中打印机头用作热或压电致动器在基板上产生液滴这些液滴可以支持或形成最终细胞负载构建体的一部分。

优势包括高通量能力、高分辨率、低成本、可重复性和相对较高的细胞存活率

90。

此外该技术可用于将多种细胞或蛋白质沉积到目标空间位置允许制造复杂的多细胞构建体。

劣势生物墨水必须处于液态且具有适当的粘度才能从喷嘴的小孔中喷射出来这限制了材料的选择。

2.2.2

原理起源于激光直接写入技术是激光诱导正向变换技术的改进版本用于转移生物材料如肽、DNA和细胞。

典型的激光辅助生物打印机由五个元素组成脉冲激光束、聚焦系统、包含对激光刺激响应的能量吸收层的“带状”结构供体层、液体生物墨水溶液层和用于图案化和交联生物墨水的接收基板。

优势在生物打印过程中生物墨水与分配器之间没有直接接触可防止细胞受到应力从而导致高细胞存活率

95。

此外激光辅助生物打印兼容不同类型的生物墨水和广泛的粘度范围1

300

劣势激光暴露对细胞的影响尚未完全研究清楚此外高设备成本和激光打印控制系统的复杂性是使用该技术的另一个限制。

2.2.3

原理该技术结合了流体分配系统和自动化机器人系统分别用于挤出和打印。

流体分配系统可以由气动或机械系统作为“动力源”驱动。

通过在生物打印过程中施加连续的力生物墨水被打印成不间断的圆柱形线条。

在自动化机器人系统的控制下圆柱形细丝可以被精确地制造为所需的3D定制形状结构。

优势能够打印各种粘度的生物材料包括水凝胶、生物相容性共聚物和细胞球体范围从30到6×107

mPa

s。

通常较高粘度的材料通常为打印构建体提供结构支撑而较低粘度的材料为维持细胞存活率和功能提供合适的环境。

劣势封装的细胞在打印过程中会暴露于较大的应力下从而降低细胞存活率。

三、生物墨水配方和关键生物墨水特性

生物墨水的组成用于生物打印的支架材料称为生物墨水它由生物材料溶液墨水、细胞以及存在或不存在的生长因子组成。

生物材料的选择天然如明胶、胶原蛋白、纤维连接蛋白、海藻酸盐、壳聚糖、丝素蛋白和透明质酸或合成聚合物如聚乙二醇PEG、PCL、聚乳酸

乙醇酸PLGA、聚乳酸PLA均可用于组织工程。

天然聚合物与人体细胞外基质相似且具有固有生物活性合成聚合物可根据特定应用定制物理性质。

为结合两者优势一些生物墨水是融合天然和合成材料的杂化生物材料。

脱细胞外基质dECM水凝胶由脱细胞组织制成的水凝胶如膀胱、心脏、肝脏、真皮、脂肪组织、骨和肺等被开发并报道可支持不同细胞类型的生长和功能。

Pati等人展示了来自三种组织软骨、心脏、脂肪组织的dECM可溶解成生物墨水并进行生物打印。

dECM生物墨水包含不同组织特有的细胞外基质成分因此更接近天然组织。

尽管dECM生物墨水的低粘度会影响机械性能和形状保真度但它是生物墨水的有前途的补充。

交联机制根据已生物打印的多种水凝胶有化学离子化合物、pH、物理温度、光和酶促三种交联机制。

生物墨水的凝胶化过程有时包括几种交联机制以打印稳定和复杂的支架。

3.2

干细胞在组织再生中的作用组织再生是一个精心协调的过程干细胞在其中发挥主要作用与生长因子一起。

干细胞具有自我更新和分化为多种功能特化细胞类型的能力。

用于工程人体组织的干细胞类型包括人骨髓间充质干细胞hMSCs、脂肪来源的干细胞ASC、人羊膜液来源的干细胞hAFSC和人骨髓间充质干细胞hTMSCs等。

诱导干细胞分化的方法在大多数情况下需要在培养基中添加外部补充剂来诱导干细胞向目标细胞表型分化。

例如将干细胞体外分化为成骨细胞和骨细胞谱系需要在细胞培养基中补充特定化合物称为成骨培养基包括β

组织特异性细胞类型的应用另一种生物打印策略是使用组织特异性细胞类型如骨组织的前成骨细胞和成骨细胞、软骨组织的软骨细胞和脂肪组织的脂肪细胞。

这些细胞具有稳定的组织表型已被用于组织再生。

同时打印不同细胞类型的意义为了模拟人体组织不仅需要工程化的复杂构建体还需要代表组织的细胞类型多样性。

3D生物打印技术能够同时以空间准确性打印不同细胞类型的能力引起了人们的极大兴趣。

例如软骨细胞和MSCs或MG63细胞的共培养已被研究用于改善软骨形成和骨形成。

3.3

生长因子的作用生长因子是控制细胞生长、增殖、分化等多种反应的可溶性信号分子通过与靶细胞上的跨膜受体特异性结合发挥作用。

使用生长因子促进组织再生的想法是直观的因为生长因子与受损人体组织的修复高度相关。

βTGF

β、********IGF、骨形态发生蛋白BMP、血管内皮生长因子VEGF和甲状旁腺激素PTH等是用于刺激干细胞分化的最广泛使用的生长因子和激素。

β超家族在胚胎发育、组织形态发生、细胞增殖和分化中起重要作用。

TGF

β1和TGF

β3已被用于MSCs的软骨形成分化和软骨形成表型维持以促进软骨和骨软骨组织再生。

BMPs特别是BMP

2、BMP

7是用于诱导异位和原位新骨形成的研究最广泛的成骨分子包括临界尺寸缺陷。

VEGF和IGF可调节血管生成骨研究中血管生成因子主要关注VEGF在新血管形成和成骨募集中的作用。

尽管PTH指导成骨活性的机制尚不完全清楚但研究表明周期性暴露于PTH可刺激大鼠和人类的骨形成。

3.4

生物墨水打印性的影响因素在选择基础组件水凝胶、细胞、生长因子时需要考虑生物墨水的可打印性。

生物墨水是否适合生物打印过程主要取决于其在特定生物打印参数条件下的物理化学性质。

其中一个特定的生物打印参数是喷嘴规格它将决定支架的分辨率、制造速度、时间以及嵌入细胞在打印过程中所暴露的剪切应力。

决定生物墨水可打印性的主要物理化学性质是其流变学性质和交联机制。

流变学参数在流变学参数中粘度是流体在施加应力时流动的阻力。

聚合物的类型、浓度和分子量决定了聚合物溶液的粘度。

打印保真度通常随着粘度的增加而增加。

然而粘度的增加意味着施加的剪切应力增加这可能对悬浮的细胞有害。

交联机制打印的生物墨水结构的交联或凝胶化对于保持其三维结构的完整性是必要的。

交联机制由选择用于打印的水凝胶决定通常可以是物理的、化学的或两者的组合。

物理交联机制依赖于非化学相互作用包括离子、立体复合物和热交联。

物理交联的水凝胶是用于生物打印的最突出的水凝胶类但一个显著的缺点是其机械性能较差。

化学交联形成新的共价键来连接凝胶前体。

化学交联可能为水凝胶提供良好的处理性能和高机械强度但需要非常严格地控制交联动力学。

生物墨水的其他特性除了可打印性生物墨水的特性如生物相容性、生物降解性、机械性能和材料仿生对于支架成熟以实现功能性人体组织也很重要。

生物相容性是指墨水支持正常细胞活动细胞附着和增殖而不引起宿主组织炎症或免疫反应的能力。

生物降解性是指墨水的理想降解速率应与细胞用其细胞外基质蛋白替代墨水材料的能力相匹配降解产物应无害且易于从宿主代谢。

机械性能是指生物墨水应提供模仿天然骨组织机械性能所需的拉伸强度、刚度和弹性为细胞提供稳定的附着、增殖和分化环境。

材料仿生是指工程生物墨水材料具有特定的生理功能需要模仿人体组织中细胞外基质成分的天然组织特异性组成和定位。

四、体外生物反应器系统用于支架成熟

3D生物打印的细胞负载支架通常在孵箱中进行静态培养培养基需要手动更换。

这种静态培养存在一些缺点如营养物质和氧气的传质限制以及废物清除问题。

4.2

为了适应单个细胞或组织的要求设计了不同类型的生物反应器用于支架成熟使其能够进行动态培养。

选择生物反应器来培养3D细胞负载支架取决于要工程化的组织及其功能性生物力学环境。

例如沃尔夫定律表明骨强度会随着骨上的机械力增加或减少而增加或减少。

下面介绍了几种常见的生物反应器

4.2.1

结构由一个带有橡胶塞作为盖子的双侧臂圆柱形烧瓶组成。

3D支架穿过连接到烧瓶盖子的针头并浸入培养基中。

使用磁搅拌棒或轴来产生细胞培养基对流为支架周围提供均匀的氧气和营养物质分布。

应用效果已被证明是一种有效的大规模体外软骨形成分化和体内软骨形成的方法。

例如Mygind等人发现与静态对照相比hMSCs负载的羟基磷灰石支架构建体在动态旋转烧瓶培养中导致细胞增殖、分化和分布增加。

Stiehler等人在PLGA支架上进行了长达3周的实验结果显示在旋转烧瓶培养中DNA含量增加第21天ALP特异性活性增强第7天和第21天Ca2

局限性剪切应力的大小在不同位置可能有很大差异因此并非所有细胞都暴露于相同的剪切应力。

此外旋转烧瓶培养成功的原因仍不确定磁搅拌棒或轴引起的机械刺激可能有助于功能组织的形成。

4.2.2

结构由两个同心圆柱体组成其环形空间包含细胞培养基。

内圆柱体静止且可渗透允许CO2气体交换以供应氧气。

外圆柱体不可渗透水平旋转产生的离心力可平衡重力。

连续旋转使细胞在培养基中温和下落并保持悬浮。

应用效果已用于工程化多种组织模型包括骨、软骨、肝、神经元组织、心肌、脂肪组织和上皮组织等。

例如Song等人证明在旋转壁式生物反应器中培养的大鼠成骨细胞比在旋转烧瓶和静态对照中扩增了10倍以上并且呈现出更好的形态、存活率和更强的形成骨组织的能力。

人类软骨祖细胞也已被证明可以使用支架和旋转壁式培养相结合的方式分化为成熟的软骨细胞。

心脏组织也已通过旋转壁式培养进行工程化产生了高度分化的组织表现出正常的各向异性电生理特性。

局限性营养物质向支架中心的运输仍然有限因为对流力无法延伸到大尺寸构建体的内部。

外壁的大旋转速度将增加质量传输而差异旋转的增加会增强支架上的剪切应力。

4.2.3

结构由一个带有一个或多个活塞的压缩室组成活塞直接向支架施加压缩载荷。

通常支持设施如机械刺激单元允许控制加载频率、应变、力和时间。

应用效果旨在模拟体内组织的自然生理加载在骨和软骨组织工程中应用越来越广泛。

例如Mauck等人证明在生理应变水平下应用动态变形加载可增强细胞

种子琼脂糖支架中软骨细胞基质的形成从而产生比自由膨胀对照组更具功能的工程化软骨组织构建体。

Sittichockechaiwut等人表明成骨细胞对机械加载高度敏感与静态条件相比1

Hz、5%应变的压缩加载对矿化基质产生和成骨相关基因表达有很强的影响。

压缩生物反应器的设计和机械加载方案在不同的组织工程中有所不同。

4.2.4

结构提供连续的培养基流过支架产生剪切应力于细胞。

培养基通过直接泵送不断再循环通过腔室从而改善营养物质和氧气向构建体的运输。

应用效果在大组织质量构建中非常有用因为它允许更精确地控制培养环境。

例如Vetsch等人开发了一种灌注生物反应器系统用于在工程化骨样组织支架上产生剪切应力力并通过微CT无创且及时地监测矿化细胞外基质的发展。

研究表明曲率对三维矿化基质形成有影响在灌注条件下矿化组织向通道内的生长更高。

大通道在任何组中都没有闭合而中、小通道在部分静态或完全灌注闭合。

流速是灌注生物反应器系统中组织工程的最重要参数之一不同的生物反应器设计和细胞类型对最佳流速范围的要求不同。

例如增加流速0.075

0.2

min至人软骨细胞接种的PLGA支架上长达5周可增加细胞外基质中糖胺聚糖的保留百分比。

Zhao等人通过结合计算流体动力学和机械调节理论证明了在不同的hMSCs负载的丝素蛋白支架的灌注生物反应器中诱导矿化的最佳流速范围在0.5

min之间。

生化测定和组织学证实了这些结果并显示高流速组中增强的成骨分化。

五、现存局限性和未来展望

血管化问题骨是一种代谢活跃的组织由骨内血管供应。

虽然骨移植植入后会自发发生血管生成但宿主来源的植入物新血管形成速度缓慢1mm/天对于临床相关尺寸的复杂工程3D构建体仅靠营养物质的扩散是无法维持的因此创建功能性血管网络对于确保营养供应和废物清除是必要的。

墨水选择墨水的选择是3D生物打印细胞负载支架用于组织再生的一个主要关注点和限制所选材料应考虑其与细胞生长和功能的兼容性以及其可打印性特征。

许多已发表的研究选择了有限范围的材料如海藻酸盐、明胶、胶原蛋白、丝素蛋白、壳聚糖、PEG和琼脂糖。

同时每种生物材料都有其特定的优点和缺点常见的方法是多材料打印但在创建细胞或生长因子的梯度方面仍然存在挑战因为需要准备许多独立的溶液。

模拟自然微环境在天然组织发育和重塑过程中不同类型的力如骨组织中的剪切应力和压缩载荷具有协同作用。

为了模拟组织的自然微环境生物反应器被开发用于对3D细胞负载支架施加组合机械力但目前的生物反应器仍难以完全模拟体内自然组织的机械加载条件。

5.2

计算机模拟使用计算机模拟模型来优化血管网络的设计将是提高营养和废物效率的有力工具。

微尺度技术该技术在创建具有嵌入式血管化和毛细血管网络的精确3D结构方面提供了灵活性通过逐层组装的方式但这种方法速度较慢且需要解决细胞在预聚合生物墨水中以及在大尺寸多日打印的早期聚合区域内的存活率问题。

127和碳水化合物玻璃来创建血管网络。

这些牺牲性材料在制造过程中打印血管化通道并提供机械支持然后在后期处理步骤中从完成的物体中去除但这会增加打印过程的复杂性并且去除方法和分解产物必须与细胞相容。

更高分辨率的生物打印机更快、更高分辨率的生物打印机将有助于解决一些当前的问题。

5.2.2

智能生物材料开发有前途的自组装材料和刺激响应性水凝胶。

自组装是在微观层面上产生材料纳米颗粒或水凝胶、细胞和蛋白质以产生新的超分子结构的方式这将为产生天然骨细胞外基质成分的复杂组合和梯度提供一种途径。

刺激响应性水凝胶可分为机械、化学、热、pH和光响应性水凝胶。

通过战略性地放置具有不同刺激响应的水凝胶可以形成具有形状变化能力的生物打印构建体。

此外通过引入细胞响应位点可以定制水凝胶支架的降解。

生物反应器的发展未来的研究将集中在更复杂的机械系统上以模拟体内自然组织的机械加载条件。

例如Shahin等人表明人类软骨细胞受益于间歇无限制剪切和压缩加载的组合应用同时产生的糖胺聚糖和II型胶原蛋白增加。

未来可能会出现3D生物打印多细胞负载支架用于心脏组织工程结合复杂的生物反应器提供生化、机械、电和灌注等不同刺激在生物反应器系统中进行体外支架成熟后形成完整的功能性心脏。

参考文献